普洱茶作为我国传统食品，已有较久的安全食用历史，目前尚没有相关的流行病毒性调查及食用毒害事例报告，从某种意义上讲，食用普洱茶的正规主导产品是安全的。然而，近几年来，普洱茶产业多次发生因卫生事件带来的严重冲击，例如：2001年普洱茶处于高速成长期，“金门、广州、云南全线追踪普洱茶”一文借题大肆攻击普洱茶不安全的不实报道，使得2002年普洱茶市场严重萎缩，产品积压，价格下跌，给普洱茶产业的发展带来了巨大的破坏，最近有关在“变质的湿仓普洱茶”中发现黄曲霉毒素的报道被一些人断章取义，借此大肆诋毁普洱茶，“普洱茶致癌”的谣传在网上传得沸沸扬扬，给普洱茶产业发展蒙上了阴影，喜欢普洱茶的消费者受到了伤害！
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　　1、遗传毒理学试验----检测是否潜在致癌的科学方法
　　流言传于无知，止于智者！人类社会的发展和科学技术的进步，饮食消费中存在着大量的安全不确定因素需要明确！现代超微量分析技术的发展推进了化学成分检出精度的不断提高，不少曾被认为是“无污染”食品或“清洁”食品远非那么纯净，而许多被宣布为有毒有害的化学物质实际上在环境中和食品中都被发现以极低数量广泛存在，可以说不存在绝对安全的食物，如何科学客观评价现代食品的安全性已变得越来越重要。
　　食品安全性评价是通过风险评估进行风险控制，利用足够的毒理学资料确定物质的安全剂量，阐明某种食品是否可以安全食用，评估食品中有关危害成分或物质的毒性极其风险大小的过程。食品安全性评价在食品安全性研究、监控和管理上具有越来越重要的意义。安全性毒理学评价也是世界贸易组织（WTO）的有关协定要求和食品法典委员会（CAC）的有关准则对食品卫生安全研究的重要法定方法。它是相关食品标准制定的国际通行的重要依据。
　　遗传毒性指环境中化学物和物理因素对生物体遗传物质造成的损害。突变是细胞的遗传物质发生改变所引起的一种生物学现象，致突变试验目的是对受试动物是否具有潜在致癌作用进行筛选。 致突变原可引发的生物体体细胞遗传物质的突变，导致各种紊乱，其中最严重的后果是肿瘤或癌症的发生，或者引发生物体生殖细胞(精子、卵子及它们的前体细胞)遗传物质的突变，导致下一代遗传性疾病发病率的升高。
　　遗传毒性试验是指对化学物改变细胞内遗传物质的能力进行测试，确定其致突变性及其对生物的影响，对可遗传损伤、致癌性以及其他有关损伤进行评价的方法。
　　本研究采用经典的遗传毒理学试验方法：小鼠骨髓微核率试验、小鼠精子畸形分析试验，鼠伤寒沙门氏杆菌回复突变试验、仓鼠肺成纤维细胞(CHL)染色体畸变试验， 以晒青毛茶为对照，对不同贮藏年份的共5种代表性普洱茶产品进行了遗传毒性安全性毒理学评价，以检测其是否具有潜在的致突变和致癌毒性。
　　2、材料与方法
　　2.1 试验材料
　　2.1.1 茶叶原料
　　为了研究普洱茶代表性产品的安全性，本研究选取了不同厂家，不同贮藏年份和不同包装形式的五个普洱茶样品作为研究对象，分别编号为：A、B、C、E、F，并选取了大叶种烘青绿茶作为对照，所用样品信息如表1.1
　　表1.1 安全试验用普洱茶样品信息
　　
　　
　　2.1.2 试验动物
　　体重为18－22克昆明种(KM)小白鼠，(由第三军医大学实验动物中心提供)
　　2.1.3 实验菌株
　　鼠沙门氏伤寒杆菌突变株 TA97、TA98、 TA100 、TA102。(由第三军医大学新药安全性评价研究中心GLP实验室提供。)
　　2.1.4 试验细胞株
　　中国仓鼠肺纤维细胞(CHL)株V79 ，(由第三军医大学新药安全性评价研究中心GLP实验室提供。)
　　2.2 试验方法
　　2.2.1茶样常规成分分析方法
　　茶叶水浸出物：全量法；茶多酚总量测定：酒石酸铁比色法；咖啡碱含量：紫外分光光度法；茶叶水分含量的测定：恒重法。
　　2.2.2 小白鼠急性毒性试验方法: 茶汤制备：A、B、C、D、E、F六个茶样→分别取样100g→沸水三次浸提(各次茶水比为1 ：20、1 ：20、1 ：10；三次浸提时间分别为20分钟、20分钟、10分钟，用200目尼龙滤布挤出茶汁)→脱脂棉过滤→合并三次浸提茶汤→减压浓缩至100毫升(75℃)装瓶灭菌备用。(其茶汤浓度为1克茶/毫升茶汤的提取液)；准备编号合格实验动物, 灌胃测试全死和不死剂量，测定六个茶样LD50的，观察记录，用bliss法统计软件对各茶样各剂量组的动物死亡情况进行统计分析。(注：实验期间的室内气温为16～26℃，湿度为70%～90%)。
　　2.2.3 小白鼠骨髓微核试验方法: 六个茶样沸水充分浸提后按一定剂量间隔24小时两次灌胃处理和个编号小白鼠，于第二次灌胃处理后6小时颈椎脱臼处死小白鼠，取小白鼠后腿股骨骨髓用小牛血清作稀释涂片，甲醇固定，用姬姆萨染色液染色涂片，用(100×10)倍油镜观察记数(每鼠不小于计数2000个嗜多染红细胞)，计算骨髓微核细胞的发生率。
　　2.2.4小白鼠精子畸形试验方法: 动物观察合格后，以环磷酰胺40mg/kg腹腔注射作阳性对照，六个茶样分别按设计剂量0、1/2、1/6、和1/20 LD50连续5天灌胃给药后，正常喂养4周后脱臼处死动物，剖腹取出附睾及精索，置于有2ml生理盐水的平皿中，剪碎。以三层擦镜纸过滤，滤液以1000转/分钟离心5分钟。沉淀物中加适量生理盐水(5滴)，振荡混匀，取其混悬液涂片，片干后甲醇固定，以2%伊红染色夜染色。在(40×10)倍显微镜下计数2000个精子中的畸变精子数(无钩、香蕉、双头、双尾混合、胖头、小头、双体、不定形、尾折、断尾、断头等)。各剂量组与阴性对照比较，以t检验法统计处理判定结果。
　　2.2.5 Ames 试验方法步骤六个茶样浸提液，按1，10，100，1000，5000(ug/皿)的剂量浓度，对鉴定合格的沙门氏杆菌TA97、TA98、TAl00、TAl02菌株以平皿掺入法培养48小时后，计数回变菌落数，并设对照和S9代谢活性诱变试验。
　　2.2.6仓鼠肺成纤维细胞(CHL)染色体畸变试验
　　E、F两个茶样不同浓度无菌茶汤细胞培养试验，通过细胞毒性试验以及直线回归法计算细胞存活率 50%细胞生长抑制浓度。根据该试验结果来设计试验剂量。试验设4个剂量组。同时设生理盐水对照及S9混合液0.5ml分别为阴性对照；直接诱变剂丝裂霉素C(MMC) 0.25g /ml及间接诱变剂环磷酰胺(CP)20μg/ml，分别为阳性对照， 茶样与细胞作用24及48h收获细胞, 制做标本。每一浓度在油镜下分析100个中期分裂相。分别记录染色体数目及结构畸变。
　　
　　3、结果与分析
　　3.1 茶样常规成分分析结果
　　表3.1 茶样常规成分分析结果
　　
　　化学分析法是食品毒理学评价的重要手段，普洱茶生化成分的分析研究已有较多的报道，本试验选检以上几个项目，以对所试茶样的情况作简要界定。检测结果表明所选茶样的常规成分具有较好的代表性。
　　3.2 各茶样小白鼠(KM)急性毒性试验结果
　　各茶样的半致死剂量(LD50)的计算, 急性毒性试验中LD50的计算有多种方法，本试验采用Bliss法统计软件对各茶样的急性毒性实验结果进行统计分析，其结果如下：
　　六个茶样的急性毒性统计结果分析(如表3.2)
　　表3.2 六个茶样的急性毒性统计分析结果
　　Table 2.8 Statistical acute toxicity results of six sample teas
　　
　　急性毒性试验是指动物一日内单次或多次(在24小时内分2～3次给药)给药后，在7天或14天中，连续观察动物所产生的毒性反应及死亡情况，从定性和定量两方面进行观察毒性反应的方法。从毒理学角度来看，任何物质都有毒性，人或动物摄入任何物质达到一定剂量都可能致死。文献报道[171]，大鼠口服蒸馏水LD50为469±51 mL Kg-1，从表6可以看出，五个普洱茶样品的LD50分别为：9.7g/kg、11.2g/kg、12.2g/kg、11.8g/kg、12.4g/kg，烘青绿茶样的LD50为7.5g/kg，表明普洱茶样的急性毒性比烘青绿茶样还低，并发现六个样品的一次灌胃量在5g/kg体重以下时喂养观察十四天没有动物死亡，低于1/2LD50的灌胃剂量灌胃后多数动物表现出神经兴奋症状；随着灌胃剂量加大，动物在十分钟后出现神经抑制症状。五个普洱茶样的急性致死时间只有一个高峰期，而烘青绿茶则有两个死亡高峰期，分析认为普洱茶引起动物死亡以及由烘青绿茶引起的第一死亡高峰是由过高浓度的咖啡碱所致，而烘青绿茶样D引起第二个动物死亡高峰则可能与过高浓度的茶多酚有关；根据WHO1977年颁布的毒性标准，六个茶样的 LD50均大于5000 mg/kg体重，可判定为实际无毒。
　　表 3.3 六个茶样的小白鼠骨髓微核试验结果
　　
　　3.3普洱茶遗传毒性——微核试验结果
　　微核试验是根据分裂间期细胞内残留染色体断片或整个染色体组成的一种圆形或椭圆形的小体，来判断化学物质引起染色体异常作用的一种简便的哺乳动物体内试验。典型的微核呈圆形，直径相当于红细胞直径的1/5～1/20，染色与核质相同。微核出现是一种染色体异常现象，微核检出率增高，可反映染色体畸变情况。由于其测定方法较简便、快速可靠，所以已作为化学致突变试验中常用的一种筛检方法。
　　从表 3.3可以看出：经六个茶样灌胃处理的昆明种小白鼠，试验结果均为阴性。表明六个茶样都不存在致染色体断裂的致突变性，各茶样处理的小白鼠骨髓微核发生率均略低于空白对照，提示所试茶样均具有一定的降低微核自然发生率的功能，即所试普洱茶样具有一定的抗突变和抗癌的作用！有大量研究报道表明茶叶及其多酚类以及儿茶素类具有抗染色体损伤的功能，也有人研究发现绿茶可以降低某些重金属导致的微核率的增加。
　　3.4普洱茶遗传毒性--小白鼠精子畸形检测试验结果
　　精子畸形是指精子形状的畸形和畸形精子数量增多，畸形精子增多的原因可能是由于在精子形成过程中， 致突变源使精子形成有关的基因发生突变或某些特异染色体的重排。精子畸形试验根据受试化学物如能影响实验动物的精子成熟过程，则可观察到精子头部或尾部的形态变化。
　　精子畸形试验是检验生殖细胞染色体毒性的一种手段，A、B、C、D、E、F六个茶样按各自得1/2 LD50、1/6 LD50、1/20 LD50各剂量处理后，其畸形精子率与阴性对照没有显著性差异，而阳性对照则比阴性对照有显著性增加，因此判定六个茶样各剂量的畸形精子检测结果为阴性，四茶样所试剂量对生殖细胞没有致畸变作用。
　　3.5 Ames试验结果
　　鼠伤寒沙门氏菌营养缺陷型回复突变试验通常简称Ames试验，它是1975年由Ames本人完整地提出的用微生物检测致突变物的方法，是目前检测基因突变最常用方法之一。Ames法基本原理是鼠伤寒沙门氏杆菌的突变型(即组氨酸缺陷型)菌株在无组氨酸的培养基上不能正常生长，只有少数自发回变菌落生长。在有组氨酸的培基上可以正常生长，但在无组氨酸的培基中如有能引起该菌基因碱基置换或移码突变的致突变剂存在，则突变型发生回复突变，回变为组氨酸非缺陷型野生型，即又可在无组氨酸培基上生长，使细菌生长增多。某些致突变剂需要激活后才能引起沙门氏菌突变型发生回复突变，由大鼠肝匀浆制备的哺乳动物体内肝微粒体多功能氧化酶S9混合液进行受试化学物质的代谢激活作用。测定致突然变异性物质所引起的复归突然变异频度，即可以检查受试物是否为致突变物质。
　　根据Ames试验结果判定准则，当试验受试物诱变的回复菌落数(X±S)增加，为自发对照的2倍或以上，并具有剂量效应或某一测试点可重复的统计学意义增加时为阳性，从六茶样四菌株各水平实验结果看，六个茶样四菌株均显阴性。因此可以得出结论为普洱茶及烘青绿茶对TA98、TAl00、TA97及TAl02四菌株不存在明显的抑菌现象，不会诱导四菌株发生回复突变，三种类型普洱茶及烘青绿茶中没有引起四菌株基因碱基置换或移码突变的致突变剂存在。
　　3.6 CHL染色体畸变试验结果
　　用CHL染色体畸变试验评价F、E两个普洱茶样的致突变性本试验结果表明，无论是24h及48h收获细胞进行染色体畸变分析，空白对照、溶媒对照、S9混合液对照染色体畸变率在正常范围，在S9活化和非活化两种测试条件下，普洱茶E在试验设计浓度范围内染色体畸变率都在正常范围，证明了普洱茶E、F在设计剂量条件下对CHL细胞没有致突变性。
　　
　　4、讨论与结论
　　4.1 普洱茶具有较高的饮用安全性
　　试验结果表明：A、B、C、E、F五个代表性三种类型普洱茶的小白鼠灌胃LD50分别为9.7、11.2、12.2、11.8、12.4克/公斤体重。而烘青对照样的LD50为7.5克/公斤，所测三种类型普洱茶的急性毒性都比烘青绿茶较小，且从毒理学的标准（WHO，1977）来看，六个茶样都属于实际无毒的范围。六个普洱茶样的LD50为推荐每人日饮茶量6g/d的100倍左右。因此从急性毒性角度来看，所测三种类型普洱茶的饮用安全性是很高的。从以上结果可以看出，正规厂家以及经过良好贮藏的普洱茶产品具有较高的饮用安全性。
　　4.2 普洱茶不会致突变和也没有潜在致癌性
　　从以上经典遗传毒性试验结果来看，我们所试的五个普洱茶样和烘青绿茶样对原核细胞、真核细胞、生殖细胞都没有致突变性。可以看出，正规厂家的普洱茶产品以及经过良好贮藏的普洱茶产品具有较高的饮用安全性，不会致癌！
　　4.3 试验结果表明普洱茶具有一定的抗突变和抗癌的能力
　　所测试六个茶样灌胃处理后，小白鼠骨髓微核发生率均略低于空白对照，提示所试茶样均具有一定的降低微核自然发生率的功能，即所试普洱茶样具有一定的抗突变和抗癌的作用！这与大量研究报道表明茶叶及其多酚类以及儿茶素类具有抗染色体损伤、抗突变和抗癌功能的报道是相一致的。
　　参考文献
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